Método: Secretoma de líneas celulares

Descripción

Antelmann y colaboradores acuñaron el término de “secretoma”, y se define como un subgrupo del proteoma que activamente se secreta fuera de la célula, por lo cual, obtiene su nombre. El secretoma de las células y de los tejidos puede reflejar una amplia variedad de condiciones patológicas y representa una fuente muy rica para la búsqueda de biomarcadores. Las proteínas secretadas, se aísla generalmente de sobrenadantes de cultivos celulares o de fluidos corporales, haciendo difícil su identificación y análisis, porque estas proteínas se enmascaran a menudo con otras de altas concentraciones (Greenbaum, Luscombe, Jansen, Qian, & Gerstein, 2001; Zwickl et al., 2005).

Material y equipos

1. Botellas de cultivo de ≥500 cm²
2. Medio de cultivo con y sin Rojo Fenol
3. Micropipetas y pipetas para cultivo
4. Antibiotico-Antimicotico
5. Incubadora con inyección de CO₂
6. Centrifugaas
7. Membranas de PVDF 0.22 µm
8. Liofilizador
9. Congelador o Ultracongelador

Reactivos

1. Nitrógeno líquido
2. Acetona
3. Disolución fisiológica
4. Sacarosa
5. Tris-Base
6. KCl
7. HCl
8. EDTA
9. 2-Mercaptoetanol
10. PVPP
11. Urea
12. Tiourea
13. CHAPS
14. TBP
15. Anfolinas
16. DTT
17. Acetato de amonio
18. Metanol
19. Bradford

Procedimiento

1. Las líneas celulares se cultivan con  medio Advanced-RPMI 1640 suplementado con antibióticos (Anti-anti, Gibco) y sin suero fetal bovino (SFB) a una temperatura de 37°C, 5% de CO2 y un ambiente saturado de humedad.
2. Para obtener los sobrenadantes, las líneas celulares  se deben crecer hasta el 70% de confluencia en botellas de cultivo (recomendado 500 cm²)
3. Se lavan con abundantemente con disolución fisiológica (~800 mL) y se incuban por 20 h con medio fresco RPMI-1640 sin rojo fenol y sin SFB.
4. El sobrenadante se colecta y se centrifuga a 4,500 g por 5 min y posteriormente se filtra con una membrana de PVDF (0.22 µm) para eliminar cualquier célula en suspensión.
5. Las muestras se congelan en nitrógeno líquido y se liofilizan durante 48 horas o hasta que estén completamente deshidratadas
6. Posteriormente se resuspende la muestra en un volumen entre 1-10 mL y se precipitan las proteínas con acetona fría al 90% por ≥2h a -20°C
7. Se centrifuga a 5,000 g por 20 min, el botón se resuspende en un vortex
8. Se agregan 5mL de buffer de extracción (ver abajo: Tabla 1)
9. Se agrega un volumen igual de fenol para separar las proteínas y se agita durante 20 min
10. Se centrifuga a 7,000 g por 10 min, y se recupera la parte orgánica
11. Posteriormente se precipita con 5 volúmenes de acetato de amonio 0.1M en metanol por ≥2 h a -80°C.
12. Después se centrifuga y se obtiene un botón que será lavado 2-3 veces con 2 mL de acetona fría al 90% y un lavado con 500µL acetona fría absoluta.
13. Se evapora la acetona con una centrifuga de vacio sin llevar sequedad la muestra
14. Se agregan entre 50-100 µL de buffer de solubulización (ver abajo: Tabla 2). NOTA: se puede emplear buffer Leammli para ensayos de 1D o este buffer para 2D-PAGE 
15. Se procede a determinar la concentración proteica mediante el método de Bradford.
    

    Tabla 1. Buffer de extracción

    Concentración Final	Reactivo	para 200mL
    0.7 M	Sacarosa	47.922 g
    0.5 M	Tris-Base	12.11 g
    0.1 M	KCl	1.4 g
    30 mM	HCl	0.48 mL
    50 mM	EDTA (292.24 g/mol)	2.9224 g
    2% v/v	2-Mercaptoetanol	4 mL
    1.2% p/v	PVPP	2.4 g

    Tabla 2. Buffer de solubilización de proteínas

    Concentración Final	Reactivo	Para 5ml
    7 M	Urea	2.1033 g
    2 M	Tiourea	0.761 g
    4%	CHAPS	0.2 g
    2 mM	TBP	0.05 mL
    2%	Anfolinas 3-10pH	0.1 mL
    60 mM	DTT	0.04627 g

    Resultados